Chiết xuất lá tràm điều trị ký sinh trùng trên tôm càng xanh

Nghiên cứu

Đầu tiên, lá tràm được rửa với nước để loại bỏ bụi bẩn trước khi phơi khô trong bóng râm trong 72 giờ. Lá khô sau đó được nghiền thành bột bằng máy nghiền (Waring, Mỹ). 35 g bột lá tràm được ngâm trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng và trong máy lắc đã ủ (Max Q Mini 400, Thermo Fisher Khoa học, Mỹ), trong 1.000 ml metanol 80%. Hỗn hợp này được lọc bằng giấy lọc Whatman và dịch lọc được cô đặc thêm bằng thiết bị cô quay (Buchi, Flawil, Thụy Sĩ) (150 vòng/phút, 35 – 38^oC) cho đến khi tạo thành dịch chiết thô nhớt màu nâu sẫm. Dịch chiết thô được đông khô bằng máy sấy đông lạnh (Labconco 117, Cộng hòa Séc), và bột chiết lá tràm (MCLE) được thu thập và bảo quản trong tủ lạnh (-20^oC) cho đến khi sử dụng.

4 nồng độ MCLE đã được sử dụng trong nghiên cứu này (lần lượt là 0; 0,28; 0,57 và 0,85 g/l), trong đó 0 g/l được dùng làm đối chứng. Tổng cộng có 120 con tôm càng xanh khỏe mạnh được phân phối ngẫu nhiên vào các bể kính 10 l chứa dung dịch MCLE với 10 con tôm/bể và 3 lần lặp lại. Các thông số nước bao gồm nhiệt độ, độ mặn, ôxy hòa tan và pH đều được duy trì ở 26^oC, 0,05 ppt, 6 – 7,5 mg/l, pH 6,6 – 7,2, tương ứng bằng cách sử dụng đầu dò đa thông số YSI (YSI Inc., Mỹ). Tôm chết đều được loại bỏ để ngăn ngừa ô nhiễm và suy giảm chất lượng nước. Các thông số được đánh giá bao gồm: đạm tổng số (TP); phosphatase axit (ACP); phosphatase kiềm (ALP); hoạt độ phenoloxidaza (PO); tổng số lượng tế bào máu (THC); số lượng tế bào hồng cầu biệt hóa (DHC); tế bào hạt (GC) và tế bào hyaline (HC) và độ nhạy của MCLE trên ký sinh trùng P. buitendijki.

Kết quả

Các hợp chất hóa học trong MCLE

Có 24 hợp chất được xác định có trong MCLE bằng phân tích GC-MS, với các hợp chất chính bao gồm 2-isopropyl-10-methylpenanthrene, phenanthrene, 1 -metyl-7-(1-metyl etyl)-, và 4H-1-benzopyran-4-one, 3-axetyl-5, 7-dihydoxy-2-metyl, với giá trị phần trăm là 23,35 % ở thời gian lưu giữ 32,23 phút. Cả 2-isopropyl-10-metylpenanthren và phenanthren, 1-metyl-7-(1-metyl etyl) đều là thành viên của nhóm phenanthren và được phân loại tương ứng là diterpen và stilben. Trong khi đó, 4H-1-benzopyran-4-one thuộc nhóm flavonoid.

Trong nghiên cứu này, 2-isopropyl-10-metylpenanthren, phenanthren, 1-metyl-7-(1-metyl etyl)-, và 4H-1-benzopyran-4-one, 3-axetyl-5, 7-dihydoxy- 2-metyl được phát hiện là hợp chất chính trong MCLE. Cả 2-isopropyl-10-metylpenanthren và phenanthren, 1-metyl-7-(1-metyl etyl) đều là thành viên của nhóm phenanthren và được phân loại tương ứng là diterpen và stilben. Trong khi đó, 4H-1-benzopyran-4-one thuộc nhóm flavonoid. Tất cả các hợp chất này sẽ hoạt động hiệp đồng để thúc đẩy các đặc tính sinh học (Santos et al., 2014).

Kết quả về phản ứng sinh hóa và miễn dịch của tôm càng xanh đối với MCLE

Bảng 1 và 2 lần lượt mô tả các ảnh hưởng đến sinh hóa và huyết học của tôm tiếp xúc với MCLE. Kết quả cho thấy rằng tất cả các thông số bao gồm hoạt động TP, ALP và PO đều cao hơn ở tôm được xử lý MCLE so với đối chứng, với sự khác biệt đáng kể (p<0,05) trong hoạt động ALP và PO. Xu hướng tăng được quan sát thấy trong hoạt động PO của tôm được xử lý MCLE và PO cao nhất đạt được ở mức 0,85 g/l MCLE. Hoạt tính của ALP được tìm thấy tăng trong 0,28 và 0,57 g/l MCLE, sau đó giảm trong 0,85 g/l MCLE. Mặt khác, giảm hoạt động ACP đã được tìm thấy trong MCLE được xử lý bằng tôm so với đối chứng. Đối với THC, có sự gia tăng ở tất cả tôm được xử lý MCLE so với đối chứng, ngoại trừ 0,57 g/l MCLE. Một sự khác biệt đáng kể (p<0,05) về THC đã được quan sát thấy ở tôm tiếp xúc với 0,85 g/l MCLE. Trong khi đó, số lượng tế bào SGC trong tôm tiếp xúc với MCLE tăng mạnh (p <0,05) so với đối chứng. Ngoài ra, có sự gia tăng đáng kể (p <0,05) trong GC và HC của tôm tiếp xúc với MCLE 0,85 g/l.

Các phát hiện của nghiên cứu hiện tại cho thấy THC tăng đáng kể ở tôm được xử lý MCLE so với đối chứng. Sau THC, mức độ GC và HC tăng lên đáng kể, tỷ lệ thuận với sự gia tăng nồng độ MCLE. Trong số các phương pháp điều trị MCLE, 0,85 g/l MCLE tạo ra hàm lượng tan máu cao nhất (p <0,05).

Bảng 1. Các thông số sinh hóa của tôm càng xanh sau khi tiếp xúc với MCLE trong 24 giờ

Các số liệu trong một hàng không có ký tự chỉ số chung chung thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <0,05)

Bảng 2. Các thông số huyết học của tôm càng xanh sau khi tiếp xúc với MCLE trong 24 giờ

Các số liệu trong một hàng không có ký tự chỉ số chung chung thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <0,05)

Những thay đổi về hình thái của P. buitendijki sau khi tiếp xúc với MCLE được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Hình 1: Mặt lưng của các đặc điểm hình thái của P. buitendijki cái trưởng thành sau khi tiếp xúc với các nồng độ MCLE khác nhau: A 0 g/l (đối chứng); B 0,28 g/l; C 0,57 g/l; Đ 0,85 g/l

Hình 2: Đặc điểm hình thái của ấu trùng P. buitendijki sau khi tiếp xúc với các nồng độ MCLE khác nhau: A 0,00 g/L; B 0,28 g/L, mũi tên ấu trùng chết; C 0,57 g/L, mũi tên chỉ trứng rỗng ruột; Đ 0,85 g/L

Hình 3: Mặt lưng của các đặc điểm hình thái của P. buitendijki đực trưởng thành sau khi tiếp xúc với các nồng độ MCLE khác nhau: A 0 g/l (đối chứng), B 0,28 g/l, C 0,57 g/l và D 0,85 g/l. Mũi tên cho thấy bề mặt bị vón cục và móp méo

Sau 1 giờ điều trị, tất cả con đực, con cái và ấu trùng P. buitendijki trưởng thành trong nhóm đối chứng vẫn còn sống, với hình thái và hình dạng cơ thể được bảo tồn (Hình 1A, 2A và 3A). Ở 0,28 g/l MCLE, cả P. buitendijki đực và cái trưởng thành đều bị thu nhỏ kích thước, nhưng vẫn giữ được các cấu trúc có thể nhận dạng, đặc biệt là chân túi của chúng (Hình 1B và 2B). Trong khi đó, ấu trùng bị nát và hợp lại thành những hình cầu không đều nhau, nhưng không quan sát thấy trứng bị vỡ (Hình 3B). Xu hướng nghiêm trọng tương tự cũng được quan sát thấy ở ký sinh trùng đực và cái trưởng thành ở 0,57 g/l MCLE, trong đó kích thước cơ thể của chúng giảm và nhỏ lại so với đối chứng (Hình 1C và 2C). Ở giai đoạn ấu trùng, những quả trứng rỗng hình thành và một số bị vỡ (Hình 3C). Ảnh hưởng đáng kể đã được quan sát thấy trong tất cả các giai đoạn tăng trưởng của P. buitendijki được xử lý MCLE ở 0,85 g/l MCLE, trong đó cơ thể chúng co lại, với vùng lưng bị lõm được quan sát thấy ở cả ký sinh trùng đực và cái trưởng thành (Hình 1D và 2D). Tương tự, ở nồng độ này, ấu trùng mất dạng hình cầu và tất cả đều bị vỡ (Hình 3D).

Kết quả cho thấy rằng việc tiếp xúc với MCLE có thể thúc đẩy lợi ích sức khỏe và khả năng miễn dịch ở tôm càng xanh M. rosenbergii. Trong khi đó, việc sử dụng MCLE ở mức thấp 0,28 g/l trong 1 giờ có thể phát huy tác dụng tiêu diệt cả con đực trưởng thành, con cái trưởng thành và ấu trùng của ký sinh trùng P. buitendijki.

Lê Chinh