Phụ gia thức ăn chức năng: Khả năng phòng chống dịch bệnh EMS/AHPND

Ngành công nghiệp nuôi tôm đòi hỏi có những biện pháp mới để kiểm soát hệ sinh thái vi sinh vật trong các hệ thống sản xuất. Phương pháp tiếp cận bền vững để cân bằng hệ vi sinh đường ruột ở tôm bao gồm việc sử dụng các hợp chất tự nhiên có khả năng điều chỉnh hệ vi thực vật thành các hoạt chất hữu ích như probiotics, các axit hữu cơ, chất chiết xuất từ nấm men và phytobiotics. Tác dụng hiệp đồng giữa các hợp chất kể trên rất có thể sẽ xảy ra, ví dụ phytobiotics có thể gia tăng sự hình thành vi khuẩn probiotic, do đó tăng cường tác dụng của probiotic trong các hệ thống sản xuất. Thức ăn chức năng có chứa hoạt chất cải thiện sức khỏe đường ruột cho phép cung cấp vào mỗi cữ ăn của tôm lượng kháng sinh tự nhiên vừa đủ trong ruột tôm. Những loại thức ăn như vậy có thể là giải pháp quan trọng trong phòng bệnh EMS.

Tuy nhiên, sự thành công của phương pháp này phụ thuộc tính hiệu quả của hoạt chất cải thiện sức khỏe đường ruột được chọn lọc để chống các vi khuẩn gây bệnh liên quan EMS. Chất phụ gia điều chỉnh đường ruột nên được xử lý nhiệt ổn định và do đó có thể dễ dàng kết hợp vào thức ăn tại nhà máy và được bổ sung trong mỗi cữ ăn từ giai đoạn đầu trở đi, mà không đòi hỏi sự thích nghi của vật nuôi tại ao ươm hoặc trang trại. Chất phụ gia tự nhiên kết hợp các cơ chế hoạt động khác nhau đối với các loài Vibrio như đặc tính diệt khuẩn/kìm khuẩn trực tiếp cũng như tính chất ức chế hệ thống giao tiếp đặc hiệu (Quorum Sensing) dưới nồng độ ức chế tối thiểu, là phương pháp hứa hẹn nhất để giảm tác động của EMS.

Trong nghiên cứu này, có ba loại chất phụ gia giúp cải thiện sức khỏe đường ruột khác nhau được đánh giá về khả năng làm giảm tác động của AHPND trên sự hình thành vi khuẩn Vibrio trong hệ thống tiêu hóa của tôm và tỷ lệ tử vong trong 2 tuần sau khi nhiễm.

Bố trí thử nghiệm

Thử nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm ShrimpVet Minh Phú AquaMekong (MPA). Tôm thẻ chân trắng Juvenile (Penaeus vannamei) được cho ăn khẩu phần ăn thương mại trộn lẫn một trong ba phụ gia trong 21 ngày trước khi thử nghiệm lây nhiễm EMS gây ra bởi chủng Vibrio parahaemolyticus. 15 ngày sau giai đoạn theo dõi thử nghiệm, tôm tiếp tục được cho ăn khẩu phần ăn giống thời điểm trước thử nghiệm để xác định phụ gia thức ăn chức năng có thể bảo vệ tôm chống lại Vibrio parahaemolyticus hay không.

Ấu trùng sạch bệnh 12 ngày tuổi (PL 12) được chuyển từ trại giống sang MPA để nuôi dưỡng trong môi trường an toàn sinh học nghiêm ngặt thêm 45 ngày tới khi đạt trọng lượng 1 – 2 g. Một ngày trước khi bắt đầu thử nghiệm, tôm 1 – 2 g/con được chuyển tới bể chứa 90 lít. Tất cả tôm trong những bể này được cho ăn khẩu phần ăn tương ứng của chúng trong 21 ngày, khoảng 5% trọng lượng cơ thể/ngày. Tất cả bể chứa được trang bị bộ lọc vỏ sò, sục khí và được phủ bằng bạt nhựa để giảm nguy cơ nhiễm chéo.

Lô đối chứng dương được cho ăn khẩu phần đối chứng (thức ăn thương mại ép viên) trong 21 ngày. Ba loại phụ gia khác nhau, đặc tính chống vi khuẩn được đánh giá với khẩu phần đối chứng không bổ sung phụ gia. Khẩu phần 1 chứa SANACORE, hỗn hợp hiệp lực của các chất kháng khuẩn tự nhiên đa tác động gồm kiềm khuẩn và ức chế giao tiếp của vi khuẩn (Quorum Sensing); Khẩu phần 2 chứa phyto – hợp chất nguồn gốc thực vật hoạt tính kháng khuẩn; Khẩu phần 3 chứa OAC – hỗn hợp axit hữu cơ.

Phương pháp thử nghiệm

Trong quá trình liên kết với Trường Đại học Thực nghiệm bệnh lý nuôi trồng thủy sản Arizona (UAZ-APL), Mỹ, MPA đã phát triển một số phương pháp thử nghiệm chuẩn, dùng trên tôm cá nhỏ với các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây EMS/AHPND mô phỏng các con đường nhiễm trùng tự nhiên (thông qua tiếp xúc nước và cho ăn trực tiếp). Trong nghiên cứu này, hai phương pháp thử nghiệm được sử dụng gồm: tiếp xúc (ngâm) và cho ăn trực tiếp vi khuẩn (bằng đường ăn).

Hình 1: Tỷ lệ sống của tôm trong 15 ngày của hai loại thử nghiệm nhiễm EMS / AHPND gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus. Dữ liệu cho thấy tỷ lệ sống của lô đối chứng âm (không thử nghiệm) và lô đối chứng dương (thử nghiệm, cho ăn thức ăn đối chứng), và ba phương pháp thử nghiệm (thửnghiệm, cho ăn thức ăn đối chứng có bổ sung chất phụ gia sức khỏe khác nhau).

Đối với các thử nghiệm tiếp xúc, môi trường Tryptic Soy Broth + 2% Natri clorua (TSB +) được tiêm chủng độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (chủng LA37),ủ 18 giờ ở 28°C, sau đó cho trực tiếp vào bể để đạt được mật độ vi khuẩn  3×105 tế bào/ml, được đo bởi mật độ hấp thụ quang học (OD600 nm). Đối với thử nghiệm cho ăn trực tiếp, TSB+ chuỗi vừa được tiêm chủng với LA37 và ủ trong 18 giờ, được trộn với thức ăn nuôi tôm thương mại ở mức 20% để trong không khí khô 15 phút. Cho tôm ăn thức ăn bọc vi khuẩn theo tỷ lệ 3% trọng lượng cơ thể mỗi cữ ăn. Lô đối chứng âm được cho ăn với khẩu phần ăn thương mại nhưng được thử nghiệm với TSB+ vô trùng thay vi khuẩn.

Hai nhóm tôm được bảo quản trong AFA cố định Davidson trước khi bắt đầu thử nghiệm về tình trạng sức khỏe SPF của tôm được gây nhiễm WSSV, TSV, EMS/AHPND, và IMNV vào ngày 0. Tổng số tôm nhiễm vi khuẩn Vibrio được đếm trên TCBS vào ngày 5, 10 và 15 sau thử nghiệm của mỗi lô thử nghiệm. Tôm lấy mẫu được bóc vỏ, đồng nhất trong nước mặn và pha loãng trước khi đặt trên các đĩa khác nhau để đếm. Các bồn thử nghiệm được kiểm tra hai lần mỗi ngày; tất cả tôm chết được thu gom, loại bỏ ra khỏi bể và làm đông lạnh dùng cho thử nghiệm PCR sau đó. Vào ngày 21 (ngay trước khi thử nghiệm) và vào ngày 5, 10, 15 sau thử nghiệm 3 con tôm đang hấp hối của mỗi lô thử nghiệm được bảo quản trong dung dịch cố định Davidson’s AFA và được xử lý mô học và PCR để xác định sự hiện diện bệnh lý của EMS/AHPND. Tại cuối thử nghiệm, tất cả tôm còn sống được tính là số tôm sống sót.

Kết quả và thảo luận

Các phân tích mô học cho thấy tôm trong lô đối chứng âm tính với EMS trong suốt thí nghiệm. Trong khi đó, tôm từ tất cả các lô thử nghiệm khác nhiễm EMS sau thử nghiệm. Điều thú vị là tôm trong lô đối chứng nhìn chung dương tính với EMS sau 5 ngày và 10 ngày sau của thử nghiệm nhưng lại không hiển thị các tổn thương của EMS sau 15 ngày thử nghiệm. Điều này cho thấy tôm có thể có khả năng phục hồi từ nhiễm EMS nếu chúng vẫn tồn tại sau thử nghiệm.

Lô đối chứng âm không thử nghiệm cho thấy tỷ lệ sống trung bình 91% trong đó chỉ ra rằng những con tôm được sử dụng trong các thử nghiệm có sức khỏe và tình trạng dinh dưỡng tốt trong suốt thử nghiệm. Sau thử nghiệm, tỷ lệ tử vong xảy ra dần dần trong 15 ngày sau thử nghiệm cho cả hai loại nhiễm trùng thực nghiệm, do sự lựa chọn của một chủng Vibrio parahaemolyticus với độc lực trung bình (Fig. 1). Tuy nhiên, trong thử nghiệm tiếp xúc, tôm nuôi bổ sung chất phụ gia thức ăn có tỷ lệ tử vong thấp hơn ban đầu so với lô đối chứng. Đây không phải là trường hợp đối với thử nghiệm cho ăn trực tiếp vi khuẩn. Tôm được cho ăn thức ăn đối chứng (lô đối chứng dương) cho thấy tỷ lệ sống đối với thử nghiệm tiếp xúc và thử nghiệm cho ăn trực tiếp vi khuẩn tương ứng là 15,6% và 26,7%.

Thức ăn được bổ sung các chất phụ gia khác nhau trong 21 ngày trước thử nghiệm và sau 15 ngày tiếp theo kể từ ngày thử nghiệm không cho kết quả khác biệt đáng kể về tỷ lệ sống so với lô đối chứng đối với bất kỳ phương pháp thử nghiệm (tỷ lệ sống trung bình 16,7 – 42,9%;. Hình 2) .

Hình 2: Tỷ lệ sống của lô đối chứng dương và 3 lô thử nghiệm các loại phụ gia khác nhau, thử nghiệm gây nhiễm bằng 2 phương pháp tiếp xúc và cho ăn trực tiếp vi khuẩn.

Tuy nhiên, tỷ lệ sống cuối thử nghiệm chỉ ra một số xu hướng khác nhau tùy theo thử nghiệm tiếp xúc và thử nghiệm cho ăn trực tiếp vi khuẩn; Hình 2.). Tôm được bổ sung SANACORE có xu hướng thể hiện tỷ lệ sống cao hơn so với đối chứng ở cả hai loại thử nghiệm (+ 107% trong thử nghiệm tiếp xúc, + 62% trong thử nghiệm cho ăn trực tiếp vi khuẩn). Lô thử nghiệm bổ sung hỗn hợp thực vật (Phyto) cho thấy tỷ lệ sống cao hơn nhưng chỉ trong thử nghiệm tiếp xúc (+135%). Các lô được bổ sung với axit hữu cơ (OAC) không cho thấy bất kỳ tác dụng nào trong cả 2 thử nghiệm.

Việc thử nghiệm cho kết quả tổng thể tỷ lệ sống cao nhất trong lô thử nghiệm (Sanacore) luôn thể hiện số lượng vi trùng thấp nhất trong hệ tiêu hóa của tôm so với các phương pháp thử nghiệm khác, cả tổng số dị dưỡng và tổng số vi khuẩn Vibrio (Hình 3). Đáng lưu ý là tổng số Vibrio đếm được thấp hơn so với lô đối chứng đã được thành lập đối với thử nghiệm sau 3 tuần quen với điều kiện môi trường và khẩu phần ăn (ngày 0 trong. Hình 3).

Hình 3: Tổng số vi khuẩn Vibrio đếm được trong đường tiêu hóa của tôm trong giai đoạn sau thử nghiệm với lô đối chứng dương và 3 lô thử nghiệm chất phụ gia khác nhau, thực nghiệm gây nhiễm bằng hai cách thử nghiệm tiếp xúc và thử nghiệm cho ăn trực tiếp vi khuẩn. Ngày 0 cho kết quả sau 21 ngày làm quen với môi trường, phụ gia thức ăn khác nhau trước khi thực hiện thử nghiệm.

Các kết quả hiện tại của phòng thí nghiệm bằng cách gây nhiễm AHPND có kiểm soát phù hợp với kết quả thu được gần đây từ các thử nghiệm thực tế tại Mexico và Việt Nam trong các trang trại bị ảnh hưởng EMS. Những dữ liệu thực nghiệm chỉ ra rằng các chất phụ gia hỗ trợ sức khỏe làm tăng tỷ lệ sống từ mức trung bình (60 – 70%) lên mức chưa nhiễm EMS (> 85%). Tuy nhiên, kết quả trang trại cũng cho thấy rằng các chất phụ gia thức ăn chăn nuôi như trên giữ vai trò thiết yếu trong chiến lược quản lý trang trại nhằm kiểm soát cân bằng vi sinh vật trong suốt chu kỳ sản xuất.