Phương pháp mới kiểm tra trực quan vi khuẩn gây bệnh AHPND

Bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease – AHPND) là một trong những nguyên nhân gây ra EMS, ban đầu được gọi là Hội chứng hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome – AHPNS) ở tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) và tôm sú (Peneus monodon) nuôi ở Trung Quốc vào năm 2009. Sau đó, AHPNS được đổi tên thành AHNPD khi vào năm 2013 tác nhân gây bệnh được tìm thấy là dòng phân lập mới của Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) chứa plasmid 69 kbp (pAP1) mang các gen gây độc là Pir^vpA và Pir^vpB.

Hậu ấu trùng tôm sú

AHPND lây lan từ Trung Quốc sang Việt Nam, Malaysia, Thái Lan, Mexico và Philippines. Ở Thái Lan, AHPND được nhận biết lần đầu vào năm 2012, trước khi được biết là tác nhân gây bệnh, dẫn đến sự sụt giảm về sản lượng tôm.

Sau khi các đặc điểm của VPAHPND được mô tả, trọng tâm chính của chiến lược kiểm soát AHPND là giám sát tôm bố mẹ và hậu ấu trùng không bị nhiễm VPAHPND bằng các phương pháp khuyếch đại acid nucleic (DNA – ND), là phương pháp yêu cầu những dụng cụ, thiết bị phức tạp và có chi phí cao mà không dễ dàng gì áp dụng trong điều kiện trang trại nuôi tôm.

Các nhà khoa học đã nghiên cứu một phương pháp đơn giản hơn nhưng có độ nhạy tương đương để phát hiện VPAHPND dựa trên sự khuyếch đại đẳng nhiệt mạch trung gian (LAMP) kết hợp với việc đọc trực quan không cần sử dụng các sản phẩm khuyếch đại tích cực bằng cách sử dụng DNA chức năng, ssDNA được gán các hạt nano vàng (AuNP) như là một đầu dò. Mục tiêu của bộ 6 đoạn mồi đặc biệt LAMP là gen VPAHPND Pir^vpA. Phản ứng LAMP được thực hiện ở 65⁰C trong 45 phút, sau đó thêm vào dung dịch AuNP có màu đỏ và tiếp tục ủ ở 65⁰C trong 5 phút cho phép bất kỳ đơn vị siêu sao chép gen Pir^vpA lai với đầu dò. Sự lai tạo sẽ ngăn cản các AuNP kết hợp với nhau, vì thế màu của dung dịch vẫn đỏ sau khi muối được thêm vào nếu kết quả dương tính, trong khi sự kết hợp các AuNP dẫn đến dung dịch đổi màu từ đỏ sang tím xanh và kết tủa nếu kết quả âm tính.

Sơ đồ minh họa quá trình phát hiện VPAHPND bằng phương pháp mới

Giới hạn phát hiện (100 CFU) có thể so sánh với các phương pháp thông dụng khác như phương pháp PCR tổ hợp và có độ nhạy hơn gấp 100 lần so với PCR 1 bước (104 CFU) sử dụng sự phát hiện đơn vị siêu sao chép bằng điện hoặc quang phổ.

Không có phản ứng chéo với các mẫu DNA có nguồn gốc từ vi khuẩn không gây ra AHPND thường được tìm thấy trong các ao nuôi tôm (bao gồm các loài Vibrio khác). Phương pháp mới này giảm đáng kể thời gian, khó khăn và chi phí cho việc phát hiện phân tử của VPAHPND trong việc thiết lập các trang trại nuôi và các trại giống tôm.