Ứng dụng liệu pháp khuẩn thực thể phòng trị bệnh trên cá hồi

Phương pháp nghiên cứu

Phân lập, nuôi cấy và định danh vi khuẩn

Vi khuẩn gây bệnh được phân lập từ thận của cá bệnh sau đó nuôi cấy trên thạch Todd – Hewitt (Difco) bổ sung 5% máu cừu (thạch máu THA). Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập được bảo quản ở nhiệt độ – 80⁰C. Tổng cộng có 36 chủng vi khuẩn được phân lập được sử dụng trong nghiên cứu này. Những chủng vi khuẩn này sẽ được quan sát hình thái bằng cách nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại khoảng 400 – 1.000 lần, kiểm tra các phản ứng sinh hóa bằng API 20 strep và phân tích gen 16S-rRNA. Chủng vi khuẩn W. ceti CECT7719 và W. ceti NC36 (Ladner, Welch et al. 2013) được dùng làm đối chứng so sánh.

Phát hiện, phân lập và định danh thực khuẩn thể

Trong quá trình phân lập vi khuẩn gây bệnh Weissellosis trên cá hồi vân. Các đốm thực khuẩn thể được phát hiện và được phân lập sử dụng dung dịch đệm SM. Sự hiện diện của các thực khuẩn thể được xác nhận một lần nữa bằng cách nhỏ 5 µl thực khuẩn thể lên đĩa thạch máu THA đã trang đều vi khuẩn của W. ceti. Thực khuẩn thể được phân lập bằng phương pháp thạch hai lớp và được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ thuần và tinh sạch của thực khuẩn thể (Adams, 1959).

Hình thái ngoài của thực khuẩn thể được xác định bằng cách nhuộm âm bản với 2% uranyl acetate và quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEM-2010 MX.

Đường cong sinh trưởng và phổ diệt khuẩn của Pwr-1

Thực khuẩn thể được thêm vào dung dịch vi khuẩn W. ceti có mật độ OD 0,8 ở 600 nm với tỷ lệ khoảng 1 thực khuẩn thể/1 tế bào vi khuẩn. Thực khuẩn thể được gây nhiễm vi khuẩn ở nhiệt độ 25⁰C trong 5 phút. Dung dịch sau đó được ly tâm ở 12.000 g trong 1 phút ở nhiệt độ 4⁰C để loại bỏ các thực khuẩn thể chưa lây nhiễm. Phần lắng dưới đáy của ống ly tâm được hòa tan trong 15 mL Todd – Hewitt broth (THB) và ủ ở nhiệt độ 25⁰C. Cứ 5 phút hút 1 mL dung dịch trong ống và ly tâm ngay lập tức trong 30 giây ở nhiệt độ 4⁰C. Số lượng thực khuẩn thể trong dịch nổi được xác định bằng cách đếm số đốm thực khuẩn thể bằng phương pháp thạch hai lớp. Thí nghiệm được thực hiện lặp lại ba lần. Thời gian tiềm tàng (latent time) và số lượng thực khuẩn thể giải phóng ra được tính toán từ các đường cong sinh trưởng của thực khuẩn thể.

Để xác định phổ diệt khuẩn của thực khuẩn thể trong điều kiện in vitro, 36 chủng vi khuẩn W. ceti đã phân lập được từ cá bị bệnh Weissellosis (Bảng 1). Nhỏ 5 μL dung dịch thực khuẩn thể có mật độ 108 thực khuẩn thể/mL lên trên đĩa thạch thạch máu THA đã trang đều các chủng vi khuẩn được lựa chọn ở trên. Các đĩa được ủ qua đêm ở nhiệt độ 250C, khả năng diệt khuẩn của thực khuẩn được đánh giá bởi sự hình thành mảng thực khuẩn thể rõ ràng, trong suốt và không có sự hiện diện của vi khuẩn (vòng vô khuẩn). Ngoài ra, thời gian hình thành vòng vô khuẩn của Pwr-1 là yếu tố để đánh giá mức độ diệt khuẩn mạnh hay yếu của Pwr-1. Cụ thể như sau: Thời gian hình thành vòng vô khuẩn dưới 4 giờ: rất mạnh (++++); từ 4 – 8 giờ: khá mạnh (+++); từ 8 – 12 giờ: mạnh (++); trên 12 giờ: có khả năng diệt khuẩn (+); không hình thành vòng vô khuẩn: không có khả năng diệt khuẩn (-).

Khả năng tồn tại của thực khuẩn thể Pwr-1 trong điều kiện bất lợi

Để xác định khả năng tồn tại của thực khuẩn thể Pwr-1 ở các giá trị pH khác nhau, pH của dung dịch THB được điều chỉnh từ 1 đến 10 bằng cách sử dụng NaOH và HCl (Wako, Nhật Bản). Sau đó, 100 μL chứa thực khuẩn thể ở mật độ 2×1011 thực khuẩn thể/mL được cấy vào 9,9 mL mỗi môi trường được điều chỉnh pH (mật độ thực khuẩn thể cuối cùng xấp xỉ 2×109 thực khuẩn thể/mL). Sau khi ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ 250C, tỷ lệ thực khuẩn thể còn hoạt động được xác định bằng cách xác định số lượng thực khuẩn thể còn tồn tại trong các điều kiện pH khác nhau bằng cách sử dụng phương pháp thạch hai lớp. Khả năng chịu nhiệt của Pwr-1 được xác định bằng cách ủ thực khuẩn thể Pwr-1 ở các nhiệt độ khác nhau là 40, 50, 60, 70, 80 và 900C trong 1 giờ. Tỷ lệ sống của mỗi mẫu Pwr-1 đã xử lý được xác định sau mỗi khoảng thời gian 15, 30, 45 và 60 phút bằng cách sử dụng thí nghiệm thạch hai lớp của Adams, 1959. Các đĩa được ủ ở nhiệt độ 25⁰C qua đêm để quan sát sự phát triển của các mảng thực khuẩn thể, từ đó đánh giá khả năng tồn tại của thực khuẩn thể ở các điều khiện nhiệt độ khác nhau. Tất cả các xét nghiệm được thực hiện ba lần.

Kết quả

Phân lập và định danh vi khuẩn

Vi khuẩn sau khi được phân lập phát triển mạnh trên thạch máu THA sau 48 giờ ủ ở nhiệt độ 25⁰C (Hình bên trái). Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy tất cả các vi khuẩn phân lập được là vi khuẩn Gram dương, hình que (Hình bên phải).

Kết quả thử nghiệm sinh hóa cho thấy, 36 chủng vi khuẩn này là đồng nhất về mặt sinh hóa và chúng có sự tương đồng cao với cả hai chủng W. ceti đối chứng (NC36 và CECT7719) về 19 trong số 20 chỉ tiêu sinh hóa được kiểm tra bằng bộ test API 20 STREP. 36 chủng vi khuẩn phân lập được và chủng CECT7719 là âm tính với chỉ tiêu arginine dihydrolase, ngược lại chủng NC36 dương tính với chỉ tiêu này. Trong khi, chủng CECT7719 dương tính với chỉ tiêu thủy phân esculin, trong khi 36 chủng vi khuẩn phân lập được và chủng NC36 là âm tính với chỉ tiêu thủy phân esculin.

Kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA của 36 chủng cho thấy, chúng có trình tự đoạn gen 16S rRNA có độ tương đồng rất cao (100%) với độ dài là 1.481 bp. Kết quả xét nghiệm PCR, tất cả các chủng phân lập từ cá hồi vân gây bệnh Weissellosis trong nghiên cứu này đều có cả hai sản phẩm khuếch đại của đoạn gen 16S rRNA đặc trưng 725 bp và sản phẩm khuếch đại 500 bp là các đoạn gen đặc trưng và liên quan đến các yếu tố độc lực bao gồm collagen-like và platelet-associated adhesive proteins. Những kết quả trên chỉ ra rằng, vi khuẩn W. ceti là nguyên nhân gây bệnh Weissellosis trên cá hồi vân trong nghiên cứu này. Điều này cũng củng cố tính đặc hiệu của đoạn mồi sử dụng trong chẩn đoán W. ceti gây bệnh Weissellosis trên cá hồi vân bằng phương pháp PCR kép đã được công bố báo cáo trước đây (Snyder et al. 2015).

Phân lập và định danh thực khuẩn thể Pwr-1

Đốm thực khuẩn thể Pwr-1 (vòng vô khuẩn do Pwr-1 tạo ra) có hình tròn, rõ ràng, trong suốt và không có sự hiện diện của vi khuẩn W. ceti với đường kính 0,7 – 2 mm (Hình 2A). Hình ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử cho thấy Pwr-1 có đường kính đầu khoảng 60 – 65 nm, đuôi hình trụ và linh hoạt với chiều dài khoảng 170 – 180 nm, chiều rộng 9 – 10 nm (Hình 2B). Theo các đặc điểm hình thái và dựa trên sự phân loại của Ackermann (Ackermann 2001), Pwr-1 thuộc về họ Siphoviridae.

Đường cong sinh trưởng và khả năng diệt khuẩn của Pwr-1

Kết quả trong Hình 3 cho thấy thời gian tiềm tàng của Pwr-1 được xác định là khoảng 25 phút và số lượng thực khuẩn thể được giải phóng là 16 thực khuẩn thể/tế bào bị nhiễm. Pwr-1 có phổ diệt khuẩn rộng và có thể lây nhiễm trên tất cả các chủng W. ceti được phân lập (n = 36) từ cá hồi vân bị nhiễm bệnh trong nghiệp cứu này. Pwr-1 không thể diệt chủng vi khuẩn W. ceti CECT7719 (phân lập từ voi mõm khoằm), chủng W. cibaria (VN16-10 và VN16-11 phân lập từ cá trắm cỏ) và Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC19435 (Bảng 1).

Khả năng tồn tại của Pwr-1 trong điều kiện bất lợi

Pwr-1 có khả năng chịu đựng tốt với khoảng pH rộng (Hình 4). Kết quả kiểm tra khả năng chịu nhiệt (Hình 5) cho thấy Pwr-1 chịu đựng khá tốt với khoảng nhiệt độ từ 40 đến 60⁰C, với hơn 90% tỷ lệ sống ở khoảng nhiệt độ 40 – 50⁰C và 63,3% tỷ lệ sống ở nhiệt độ 60⁰C sau 1 giờ.

Trương Đình Hoài và cs, Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam