Sử dụng PCR không đúng cách gây hại nhiều hơn lợi

PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Khi một sinh vật giả định (thường là vi khuẩn hoặc virus) được quan tâm đã được xác định, DNA sẽ được giải trình tự và các trình tự cụ thể là đăc trưng duy nhất đối với sinh vật đó. Các trình tự nucleotide này tạo thành cơ sở của đoạn mồi. Phần mồi là khuôn mẫu cho phản ứng. Một mẫu DNA từ sinh vật quan tâm được trộn với mồi. Đoạn mồi liên kết với chuỗi DNA tương đồng (mỗi trong số 4 base, các khối cấu tạo của DNA bắt cặp đặc biệt với nhau) nếu có mặt. PCR có thể được sử dụng để xác định xem mầm bệnh có tồn tại hay không.

Có thể tìm thấy mầm bệnh tiềm ẩn ở mức độ rất thấp cũng như xác định rằng một quá trình lây nhiễm đang diễn ra bằng cách định lượng mức độ của sinh vật thay đổi như thế nào theo thời gian. Tuy nhiên, khoa học giả đã xâm nhập vào tất cả các khía cạnh của xã hội, trong đó có NTTS. PCR bị lạm dụng rộng rãi và ít được hiểu đúng cách. Điều này có thể gây ra các vấn đề nghiêm trọng về kết quả dương tính giả, âm tính giả hoặc thậm chí phản ứng hỗn hợp gây hiểu lầm cho người nuôi.

Một số nhận định sai lầm phổ biến phổ biến ảnh hưởng trực tiếp đến giá trị tiềm năng của công cụ như sau:

Kết quả dương tính là luôn đúng

Các loại mồi được xây dựng thích hợp theo đặc trưng cho một sinh vật nhất định. Mặc dù người ta mong đợi rằng trình tự đoạn mồi là duy nhất, nhưng nếu nó không phải là duy nhất, đoạn mồi có thể phản ứng chéo với DNA từ các sinh vật khác. Mọi nỗ lực đều được thực hiện để giảm thiểu điều này bằng cách tập trung vào các gen được cho là duy nhất. Đối với một số tác nhân gây bệnh, chẳng hạn như virus gây bệnh nhiễm trùng vùng hạ bì và virus hoại tử tạo máu (IHHNV), nó không thể xảy ra ngay.

Tôm được biết là có khả năng kết hợp vào các mảnh DNA virus trong bộ gen của chúng. Trình tự mồi phải chống lại trình tự DNA phù hợp với sự lây nhiễm và không kết hợp với bộ gen vật chủ. Bản chất của công nghệ là có thể thiết kế các trình tự mồi không có ở sinh vật khác. Nói như vậy, việc phản ứng chéo dẫn đến dữ liệu sai lệch là có thật. Trong trường hợp IHHNV, nếu chúng ta đang tìm kiếm vật mang virus có thể lây lan, chúng ta phải đảm bảo rằng các trình tự mồi phù hợp với việc tìm ra virus chứ không phải là loại không lây nhiễm.

Sàng lọc quần thể bằng cách sử dụng PCR như một công cụ xác định sự vắng mặt của DNA phản ứng mồi

Công nghệ này được sử dụng rộng rãi để kiểm tra các quần thể lớn. Tuy nhiên, khi sử dụng có thể dẫn đến kết quả âm tính sai. Thiết bị phù hợp nhất để kiểm tra các cá thể xác định tình trạng đối tượng mang mầm bệnh và khả năng xuất hiện của các sinh vật cụ thể có thể dẫn đến bệnh cấp tính.

Một ví dụ điển hình của việc này là kiểm tra sự hiện diện của virus gây ra bệnh đốm trắng (WSSV). Con đường lây truyền chính của bệnh này là qua đối tượng mang mầm bệnh. Tôm bố mẹ mang virus và truyền cho tôm hậu ấu trùng (PLs), sau đó mang virus vào môi trường sản xuất. Đối với hầu hết các mầm bệnh có độc lực cao thì KHÔNG có khả năng chịu đựng. Nếu chúng có mặt và các điều kiện phù hợp để cho phép virus sinh sôi, tất cả những gì cần là một số lượng rất nhỏ mang mầm bệnh.

Hiệp hội Thủy sản Hoa Kỳ đã xuất bản một cuốn sách để giúp những người NTTS đối phó với vô số các vấn đề về dịch bệnh có thể ảnh hưởng. Họ đặt ra cơ sở thống kê để lấy mẫu quần thể. Tuy nhiên, chúng không thích hợp để sử dụng cho tôm nơi tỷ lệ sinh sản cao có đến nửa triệu trứng trở lên trong một lần đẻ.

Việc lấy mẫu phải được thực hiện ngẫu nhiên và công nghệ phải chính xác 100%. Trong các quần thể lớn, mức độ chính xác cao nhất là 98%. Điều này có nghĩa là 2% quần thể vẫn có thể mang mầm bệnh. Trong số một triệu PLs, 20.000 con vẫn có thể mang mầm bệnh và xét nghiệm PCR không cho ra kết quả đúng. Tất nhiên, việc lấy mẫu không ngẫu nhiên và bản thân việc kiểm tra rất dễ xảy ra sai sót khi không được tiến hành đúng cách.

PCR thích hợp để kiểm tra sự hiện diện của tất cả tác nhân gây bệnh giả định

Không phải tất cả các mầm bệnh đều có trong tất cả các mô. Nếu mức độ lây nhiễm rất thấp, thì điều quan trọng là phải lấy mẫu những mô được biết là mục tiêu của mầm bệnh. Hơn nữa, đối với một số mầm bệnh chỉ cần lấy mẫu là không đủ. Sử dụng WSSV làm ví dụ một lần nữa, loại virus này sao chép rất kém ở nhiệt độ nước trên khoảng 31^oC.

Ngay cả khi người ta tập trung vào các mô đích, virus có thể không hoạt động và việc phát hiện ra nó giống như mò kim đáy bể. Động vật cần được nuôi nhốt trong những điều kiện có thể thúc đẩy sự biểu hiện của virus. Giảm dần nhiệt độ nước xuống giữa 20^oC và giữ chúng trong vài ngày là cách duy nhất để chắc chắn rằng virus không tồn tại trong quần thể khi xét nghiệm bằng PCR. Nếu điều này không được thực hiện, thì không thể nói rằng trong quần thể này không có WSSV. Trên thực tế, có nhiều trường hợp được tuyên bố là không nhiễm WSSV khi virus ở trạng thái ngủ đông, dẫn đến bùng phát dịch bệnh lớn. 

Sử dụng PCR để xác định SPF.

Khái niệm Không chứa mầm bệnh cụ thể (SPF) mang tầm quan trọng lớn. Nếu người ta sử dụng định nghĩa theo nghĩa đen, điều đó có nghĩa là một mầm bệnh nhất định không có trong các đàn được thử nghiệm. Tuy nhiên, tất cả những gì đang làm là cấp độ thử nghiệm thì quần thể đàn sẽ không được coi là SPF mà không có thêm một số thông tin cơ bản. Bản thân PCR không thể tuyên bố một quần thể là SPF. SPF là một quá trình chứ không phải là kết quả của việc thử nghiệm giới hạn trên một nhóm đối tượng. 

Việc sử dụng các trung tâm nhân giống được xây dựng phù hợp (NBC) cùng với sàng lọc PCR và lịch sử đối tượng trên thực tế là cách tốt nhất để đảm bảo rằng một quần thể thực sự là SPF. 

Vì vậy, xét nghiệm PCR là một công cụ có giá trị khi được sử dụng đúng cách. Cho ra kết quả dương tính là cực kỳ quan trọng. Một kết quả tiêu cực trên một mẫu nhỏ của một quần thể lớn kết hợp với việc không theo dõi và việc thiếu sử dụng NBC được thiết kế phù hợp có thể dẫn đến một thảm họa. Điều này không có nghĩa là PCR không có giá trị. Ý nghĩa của nó là nếu chỉ dựa vào nó thì không phù hợp với mức độ an toàn sinh học đầy đủ và tính bền vững thực sự.